Ergebnisse
Sportserum Reduziert das Wachstum einer Prostatakrebs-Zelllinie in vitro (im Leben)

Um die Auswirkung von akutem Training auf das Wachstum von Prostatakrebszellen zu untersuchen, haben wir eine Trainingsintervention entwickelt, bei der 10 männliche Personen 60 Minuten lang zweibeiniges Fahrradtraining mit zunehmender Intensität durchführten. Durch Femurkatheterisierung wurden sowohl arterielles als auch venöses Blut erhalten und Serum extrahiert. Da wir uns mit der Frage der systemischen Wirkungen befassen, wurde für die Analysen arterielles Serum verwendet, das vor (Ruheserum) und nach dem Training (Trainingsserum) entnommen wurde. Die etablierte Zelllinie LNCaP wurde aufgrund ihrer naiven p53-Aktivität und moderaten Tumorbildungskapazität als Prostatakrebsmodell ausgewählt, wodurch eine fördernde oder hemmende Wirkung hervorgerufen werden konnte. Die Tumorunterstützungskapazität von LNCaP-Zellen kann durch gemeinsame Injektion von Stromazellen, z. NIH3T3-Fibroblasten [26]. Sowohl LNCaP- als auch NIH3T3-Zellen wurden 48 Stunden in vitro in Medien inkubiert, die mit Ruhe- oder Sportserum von den 10 Individuen getrennt ergänzt waren.

Sportserum von 9 von 10 Individuen hatte nach 48-stündiger Inkubation (1A und B) eine wachstumshemmende Wirkung auf LNCaP-Zellen im Vergleich zur Inkubation mit dem entsprechenden Restserum. Das Wachstum von NIH3T3-Zellen wurde um 5 einzelne Übungsseren erhöht und um 5 verringert (1C und D). Die Inkubation von LNCaP-Zellen mit gepooltem Trainingsserum von 10 Individuen für 96 Stunden führte zu einer 31% igen Hemmung des Tumorzellwachstums (p <0,05) (Fig. 2A, oberes Feld) im Vergleich zur Inkubation mit einem Pool von Ruheserum. Die Wirkung auf Prostatakrebszellen wurde in zwei weiteren niedrig malignen Prostatakrebszelllinien, Du145 und 22rv1, validiert. Das Wachstum von Du 145 war nach 96-stündiger Exposition gegenüber Trainingsserum signifikant verringert, 22rv1 zeigte einen Trend zu einem verringerten Wachstum. NIH3T3-Zellen wuchsen in Pools von Trainings- und Ruheserum gleich gut (Abbildung 2A, Bodenplatte).

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Abbildung 1. Das Wachstum von Prostatakrebszellen wird reduziert, wenn 9 von 10 Personen Belastungsserum ausgesetzt werden.

A) Wirkung auf LNCaP-Zellen, die 48 Stunden lang mit Ruhe- (Ruhe-) und Sportserum (Übung) von 10 Personen getrennt inkubiert wurden. B) Wirkung der 10 einzelnen Seren auf NIH3T3-Zellen. Die Daten zeigen alle Individuen separat (linkes Feld) und als Mittelwert ± SEM. au (beliebige Einheiten). π bezeichnet einen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied zwischen Inkubation mit Ruhe- und Trainingsserum. Quelle://journals.plos.org/plosone/article/figure/image?size=medium&id=10.1371/journal.pone.0067579.g001

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Abbildung 2. Die Inkubation mit einem Pool von Übungsserum reduziert das Wachstum von Prostatakrebszellen in vitro.

A) Wirkung einer 24-, 48- und 96-stündigen Inkubation mit normalen Medien, die mit 10% FCS (normal) ergänzt sind, Medien, die mit einem Pool von Humanserum von 10 ruhenden Personen (Ruhe) oder Serum von denselben Personen nach einem einzigen Trainingszyklus ergänzt wurden (Übung) zum Wachstum der Prostatakrebs-Zelllinie LNCaP. B) Wirkung der Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie in A) auf das Wachstum der Maus-Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3. C) Wirkung einer 96-stündigen Inkubation mit dem jeweiligen Serum auf die Prostatakrebs-Zelllinien 22rv1 und Du145. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. au (beliebige Einheiten). π bezeichnet einen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied zwischen Inkubation mit Ruhe- und Trainingsserum. 

Daten zeigen somit, dass die Inkubation mit Trainingsserum das Wachstum von Prostatakrebszellen in vitro nicht erhöhte, sondern im Vergleich zu Serum desselben Individuums in Ruhe eine konsistente wachstumshemmende Wirkung hatte. Der Effekt wurde in Analysen der einzelnen Seren sowie beim Vergleich eines Pools von Übungsserum mit einem Pool von Ruheserum gefunden. Das Trainingsserum zeigte keine wachstumsfördernde oder hemmende Wirkung auf NIH3T3-Fibroblasten, was darauf hindeutet, dass die Wirkung des Trainingsserums spezifisch für Krebszellen und nicht wachstumshemmend für kultivierte Zellen im Allgemeinen ist (1B und 2B).
Übungsserum reduziert das Tumorzellwachstum durch Hemmung der Proliferation

Um zu analysieren, ob die wachstumshemmende Wirkung von Trainingsserum auf LNCaP-Prostatakrebszellen auf eine erhöhte Apoptose und / oder eine verringerte Proliferation zurückzuführen ist, wurden AnnexinV / PI-Fluss-FACS (Abbildung S1A) und ein EdU-Inkorporationsassay verwendet.

Die Bewertung der Apoptose nach 24- und 48-stündiger Inkubation zeigte, dass sich der Anteil der apoptotischen Zellen zwischen LNCaP-Zellen, die mit Trainingsserum inkubiert wurden, und Zellen, die mit Ruheserum inkubiert wurden, nicht unterschied (Abbildung S1B und S1C). Proliferationsanalysen zeigten jedoch, dass der Einbau von EdU in Zellen, die 24 Stunden lang mit Trainingsserum inkubiert wurden, signifikant verringert war (3).

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Abbildung 3. Die Inkubation mit Trainingsserum reduziert das Tumorzellwachstum durch Hemmung der Proliferation.

Einbau von EdU in LNCaP-Zellen, die 24 Stunden lang normalem Serum, Ruhe- und Übungsserum ausgesetzt waren. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von 4 aufeinanderfolgenden Experimenten dargestellt. au (beliebige Einheiten). π bezeichnet einen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied zwischen Inkubation mit Ruhe- und Trainingsserum.

Quelle: //journals.plos.org/plosone/article/figure/image?size=medium&id=10.1371/journal.pone.0067579.g003

Diese Daten zeigen, dass das verringerte Wachstum als Reaktion auf akutes Trainingsserum eher auf die Hemmung der Proliferation als auf die Stimulierung der Apoptose zurückzuführen ist und dass der Effekt bereits nach 24 Stunden Inkubation vorhanden ist, obwohl er sich nach 96 Stunden im Wachstumstest signifikant manifestiert.
Vorinkubation mit Übungsserum verzögert die In-vivo-Tumorbildung

Wir wollten testen, ob eine Vorinkubation mit Trainingsserum das Tumorwachstum von LNCaP-Zellen in vivo beeinflusst. LNCaP-Zellen allein haben eine begrenzte Tumorbildungskapazität, wenn sie subkutan injiziert werden. Ihre Tumorunterstützungskapazität kann jedoch durch gleichzeitige Injektion von Stromazellen wie NIH3T3-Fibroblasten deutlich verbessert werden [26].

LNCaP- und NIH3T3-Zellen wurden 48 Stunden in vitro in Medien inkubiert, die mit Ruhe- oder Übungsserum von den 10 Individuen ergänzt waren, und dann SCID-Mäusen subkutan co-injiziert (4∶1). Mäuse, denen mit Übungsserum inkubierte LNCaP-Zellen injiziert worden waren, zeigten am Tag 14 nach der Injektion keine Tumorinzidenz, während Kontrolltumoren aus Ruheserum eine Inzidenz von 20% zeigten (4A und B). Die Verzögerung der Tumorbildung blieb während des gesamten Experiments bestehen und die Tumorwachstumskurven waren zwischen den beiden Gruppen signifikant unterschiedlich (4A und C). Sobald die Tumoren festgestellt waren, schien es jedoch keinen Unterschied in der Wachstumsrate zu geben.

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Abbildung 4. Vorinjektion von Tumorzellen mit Trainingsserum verzögert den Beginn des Tumorwachstums.

2 × 10 6 LNCaP-Zellen, die 48 Stunden entweder in Ruheserum oder Übungsserum inkubiert wurden, wurden NIH3T3-Zellen (4 × 1) subkutan in SCID-Mäuse co-injiziert. A) Tumorwachstumskurven von Zellen, die mit Ruhe- bzw. Trainingsserum vorinkubiert wurden. Signifikante (p ≤ 0,05) Unterschiede sind mit π bezeichnet. n = 10 Tiere pro Gruppe. B) Tumorinzidenz (Prozent der Mäuse, die Tumore tragen) am 14. Tag in der Ruhe- und Übungsgruppe. C) Streudiagramm des Tumorvolumens in Ruhe- und Übungsgruppe am Tag 34 nach den Injektionen. D) Proliferierende Zellen in Tumoren nach experimentellem Endpunkt, bewertet durch Expression des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA). E) Apoptotische Zellen in Tumoren nach experimentellem Endpunkt, bewertet durch Tunel-Färbungen. Für D) und E) sind die Daten die Anzahl der positiven Zellen pro Feld, angegeben als Mittelwert ± SEM.

Um die Annahme zu bestätigen, dass die Tumoren nach ihrer Etablierung gleich gut wuchsen, analysierten wir Tumore beider Gruppen auf Proliferation und Apoptose.

Ganze Tumorproben wurden am Endpunkt des In-vivo-Experiments geerntet und fixiert und durch Betrachten der DNA-Fragmentierung auf Apoptose analysiert. Die Proliferation wurde durch immunhistochemische Färbung auf die Expression des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) bewertet.

Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen am Ende des In-vivo-Experiments hinsichtlich der Proliferation (4D) oder der Apoptose (4E).

Die Daten stützen die Annahme, dass der anfängliche In-vivo-Effekt der Vorinkubation mit Übungsserum mit der Zeit verloren geht. Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der Trainingsreiz fehlt, sobald die Zellen in Mäuse injiziert wurden. Zusammengenommen legen die Daten jedoch nahe, dass die Wirkung von Übungsserum auf Tumorzellen in vitro auf die in vivo-Situation übertragen werden kann.
EGF und IGFBP-1 sind Kandidaten für die Ausübung der Hemmwirkung von Übungsserum

Um Kandidatenfaktoren zu identifizieren, die für die Wachstumshemmung verantwortlich sind, die bei Trainingsserum beobachtet wird, verwendeten wir einen Wachstumsfaktor-Protein-Array-Ansatz. 42 Wachstumsfaktoren und Zytokine wurden im Multiplex analysiert und als Übungsserum / Ruheserum-Verhältnis gezeigt (5A). Zusätzlich wurden die Cortisolspiegel im Serum analysiert.

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Abbildung 5. EGF und IGFBP-1 sind Kandidaten für die Ausübung der Hemmwirkung von Trainingsserum auf das Tumorzellwachstum.

A) Analyse des Wachstumsfaktorgehalts in Ruhe- und Trainingsserum unter Verwendung eines Wachstumsfaktor-Array-Ansatzes. B) Ruhe / Trainings-Serum-Verhältnis von 42 Wachstumsfaktoren und Zytokinen, analysiert im Multiplex. C) ELISA-Analyse der individuellen (linkes Feld) und durchschnittlichen (rechtes Feld) Serum-EGF-Spiegel im Ruhe- und Übungsserum, n = 9. D) ELISA-Analyse der individuellen (linkes Feld) und durchschnittlichen (rechtes Feld) Serum-IGFBP-Spiegel -1 im Ruhe- und Trainingsserum, n = 10. Die Daten werden als Einzelwerte oder Mittelwert ± SEM dargestellt. π bezeichnet einen signifikanten (p ≤ 0,05) Unterschied zwischen Inkubation mit Ruhe- und Trainingsserum.
//dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0067579.g005

Daten brachten zwei unabhängige Kandidaten heraus. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) war der Faktor, der im Vergleich zum Ruheserum die niedrigsten Werte im Trainingsserum aufwies (5B). Der Faktor mit den höchsten Spiegeln im Trainingsserum im Vergleich zum Ruheserum war Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 1 (IGFBP-1) (5B). IGFBP-1 zeigte einen Anstieg von 35% im Vergleich zu Serum, das vor dem Training eingenommen wurde, EGF zeigte 18% niedrigere Spiegel nach dem Training. Um diese Ergebnisse zu validieren, wurde ein ELISA an einzelnen Proben durchgeführt. In der ELISA-Analyse stiegen die IGFBP-1-Spiegel in hoch signifikanter Weise um das 4,6-fache (5D), während die EGF-Spiegel um 43% gesenkt wurden (5C). Darüber hinaus stiegen die Cortisolspiegel während des Trainings (Zeitpunkt 60 Minuten) an, waren jedoch bei der Ernte des Trainingsserums wieder auf die Werte vor dem Training zurückgekehrt (Abbildung S2A).

Sowohl EGF als auch IGF-1 sind mit dem Prostatakrebsrisiko verbunden. Die Bioverfügbarkeit von IGF-1 hängt von der Häufigkeit seiner Bindungsproteine IGFBP1–6 ab.

Abstrakt

Körperliche Aktivität ist mit einem verringerten Risiko für mehrere Krebsarten verbunden, einschließlich aggressivem Prostatakrebs. Die Mechanismen, die die Wirkungen vermitteln, sind noch nicht verstanden; Unter den Kandidaten befinden sich Modifikationen der endogenen Hormonspiegel. Es ist bekannt, dass Langzeitübungen den Serumspiegel wachstumsstimulierender Hormone senken. Im Gegensatz dazu umfassen die endokrinen Wirkungen von akutem Ausdauertraining erhöhte Spiegel mitogener Faktoren wie GH und IGF-1. Es kann spekuliert werden, dass die Erhöhung der Serumwachstumsfaktoren das Fortschreiten von Prostatakrebs zu Malignität beeinträchtigen kann. Der Anreiz der aktuellen Studie besteht darin, die Wirkung von akutem Trainingsserum auf das Wachstum von Prostatakrebszellen zu bewerten. Wir haben eine Übungsintervention entwickelt, bei der 10 männliche Personen 60 Minuten Fahrradtraining mit zunehmender Intensität durchführten. Serumproben wurden vor (Restserum) und nach Beendigung des Trainings (Trainingsserum) entnommen. Die etablierte Prostatakrebs-Zelllinie LNCaP wurde Belastungs- oder Ruheserum ausgesetzt. Sportserum von 9 von 10 Personen hatte eine wachstumshemmende Wirkung auf LNCaP-Zellen. Die Inkubation mit gepooltem Trainingsserum führte zu einer 31% igen Hemmung des LNCaP-Wachstums und einer Vorinkubation, bevor die subkutane Injektion in SCID-Mäuse eine Verzögerung der Tumorbildung verursachte. Serumanalysen zeigten zwei mögliche Kandidaten für den Effekt; erhöhte Spiegel von IGFBP-1 und verringerte Spiegel von EGF. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass trotz der Befürchtung möglicher nachteiliger Auswirkungen von akutem Trainingsserum auf das Tumorzellwachstum selbst die kurzfristigen Auswirkungen den insgesamt vorteilhaften Einfluss von Training auf die Neoplasie zu verstärken scheinen.

Zitat: Rundqvist H., Augsten M., Strömberg A., Rullman E., Mijwel S., Kharaziha P. et al. (2013) Wirkung von akutem Training auf das Wachstum von Prostatakrebszellen. PLoS ONE 8 (7): e67579. doi: 10.1371 / journal.pone.0067579

Herausgeber: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankreich

Eingegangen am 10. August 2012; Akzeptiert: 23. Mai 2013; Veröffentlicht: 5. Juli 2013

Copyright: © 2013 Rundqvist et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License verbreitet wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion auf jedem Medium ermöglicht, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben sind.

Finanzierung: Die vorliegende Studie wurde durch die Finanzierung von TG unterstützt: dem schwedischen Forschungsrat, dem schwedischen Nationalen Zentrum für Sportforschung, der schwedischen Ärztekammer, der KI-Stiftung und der Wallenberg-Stiftung; AÖ: Die schwedische Krebsgesellschaft und der schwedische Forschungsrat unterstützen das Linné-Zentrum und das Krebsforschungsnetzwerk „Starget“. HR wird durch ein Post-Doc-Ausbildungsstipendium der schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Diskussion

Prostatakrebs entwickelt sich über einen langen Zeitraum mit frühen PIN-Läsionen, die möglicherweise zu Prostatakrebs führen oder nicht. Es wird angenommen, dass dieser Übergang von benigner Hyperplasie zu malignem Karzinom durch Lebensstilfaktoren beeinflusst wird. Frühere Studien deuten darauf hin, dass Serum von Personen, die über lange Zeiträume aktiv waren, in vitro eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Prostatatumorzellen ausüben kann [27]. Die vorliegende Studie ist die erste, die die akuten Serumeffekte von Ausdauertraining auf das Wachstum von Prostatakrebszellen bewertet. In der aktuellen Studie präsentieren wir neuartige Daten, die zeigen, dass Serum, das direkt nach einem anstrengenden Training erhalten wurde, trotz seines mitogenen Potenzials die Proliferation von Prostatakrebs-Tumorzellen verringert. Der Effekt auf das Wachstum von Prostatakrebszellen war sowohl bei Vergleichen von Serumpools von 10 Individuen als auch bei Vergleichen der einzelnen Serumpaare signifikant.

Akutes Trainingsserum hatte keine apoptotische Wirkung auf die Tumorzellen. Dies steht im Gegensatz zu der von Barnard et al. wobei Apoptose durch p53-Aktivierung induziert wurde [16]. Anstatt Apoptose zu induzieren, fanden wir, dass akutes Trainingsserum die Rate der aktiven DNA-Synthese veränderte, die durch Einbau von EdU gemessen wurde, was darauf hinweist, dass die hemmende Wirkung hauptsächlich auf die Tumorzellproliferation zurückzuführen ist.

Interessanterweise ist die Wirkung auf Tumorzellen in vitro robust genug, um auf die in vivo-Situation hochgerechnet zu werden. Mit Übungsserum behandelte LNCaP-Zellen zeigten anfänglich ein gestörtes Tumorwachstum im Vergleich zu LNCaP-Zellen, die in Ruheserum vorinkubiert waren. Wie zu erwarten war, schien die Hemmwirkung reversibel zu sein und ging verloren, sobald die Xenotransplantate etabliert waren. In Übereinstimmung damit fanden wir keinen Unterschied in der Anzahl proliferierender oder apoptotischer Zellen, wenn Tumore geerntet wurden.

Aus dem Wachstumsfaktor-Array korrelierten zwei Faktoren mit den Wachstumsdaten und ergaben sich als mögliche Kandidaten, um den Übungseffekt zu vermitteln. reduzierte EGF-Spiegel und erhöhte IGFBP-1-Spiegel. Es ist bekannt, dass EGF das Wachstum von LNCaP-Zellen stimuliert [28]. Eine erhöhte EGF-Rezeptorexpression tritt bei Prostatakrebs auf und ist mit einer schlechten Prognose verbunden [29]. Verbindungen, die die EGF-Rezeptoraktivität bei Prostatakrebs hemmen, werden derzeit klinisch getestet [30]. EGF wird traditionell als parakrin aus der lokalen Mikroumgebung freigesetzt und nicht durch den Kreislauf bereitgestellt. Ob zirkulierende EGF-Spiegel für das Fortschreiten des Prostatakrebses von klinischer Relevanz sind, wurde unseres Wissens nicht untersucht.

Die IGF-Bindungsproteine ​​modulieren die Bioverfügbarkeit von IGF-1 und 2. Es ist bekannt, dass IGF-1 z.B. Zellproliferation und Apoptose [31] sowie hohe Spiegel an zirkulierendem IGF-1 wurden mit einem erhöhten Prostatakrebsrisiko in Verbindung gebracht [11] [32]. Es wurde zuvor gezeigt, dass Serum von Personen mit Langzeitausdauertraining eine hemmende Wirkung auf das LNCaP-Wachstum ausübt, die auf niedrige IGF-1-Spiegel und hohe IGFBP-1-Spiegel zurückzuführen ist. [16], [33], [34]. In den genannten Studien reduzierte die Zugabe von IGFBP-1 zum Kontrollserum das Tumorzellwachstum in demselben Ausmaß wie das Übungsserum.

In Studien zu akutem Training bei gesunden Personen und auch bei Prostatakrebspatienten mit Androgenentzug [35] steigen die Serumspiegel von IL-6, GH und IGF-1 an [21] [22]. In der aktuellen Studie ist kein Anstieg des Serum-IGF-1 nachweisbar. Dies kann auf eine vorübergehende Wirkungsweise zurückzuführen sein, die bereits zwei Stunden nach dem Training wieder normal ist, wenn die aktuellen Proben entnommen werden.

Solide Tumoren bestehen nicht nur aus malignen Epithelzellen. Wachstum und Fortschreiten von Tumoren hängen von einer Reihe assoziierter Zelltypen wie Fibroblasten, Gefäß- und Immunzellen ab. Die aktuelle Studie identifizierte keine Auswirkungen des Trainingsserum-Effekts auf das Wachstum von Fibroblasten. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Auswirkung von Bewegung auf die unterstützende Rolle der Zellen der Tumormikroumgebung zu bewerten.

Die aktuellen Daten zeigen einen robusten Effekt von akutem Training auf das Wachstum einer etablierten Prostatakrebs-Zelllinie. In Zukunft sind Folgestudien auf molekularer Basis für die unterschiedlichen Auswirkungen von Ruhe- und Trainingsserum auf das Wachstum von Prostatakrebszellen hoch motiviert. Vorläufige Daten legen nahe, dass die Kompensation der niedrigeren EGF-Spiegel im Serum nach dem Training durch Zugabe von rhEGF teilweise umgekehrt erfolgt die wachstumshemmende Wirkung von Trainingsserum (Daten nicht gezeigt), wodurch die Idee unterstützt wird, dass mehrere durch Training veränderte Faktoren beteiligt sind. Darüber hinaus würden Analysen der Wirkung von Trainingsserum auf die Transformation von prämalignen Prostataepithelzellen wichtige zusätzliche Informationen über die Rolle von Training bei Prostatakrebsrisiko und -progression liefern.

Zusammenfassend zeigen wir trotz der Befürchtung möglicher schädlicher Auswirkungen von akutem Trainingsserum auf das Tumorzellwachstum, dass selbst kurzfristige Effekte den insgesamt vorteilhaften Einfluss von Training auf Neoplasie zu verstärken scheinen.